Spektrofotometri UV-Vis

Spektrofotometri merupakan salah satu teknik analisis kualitatif dan kuantitatif yang cukup andal, metode ini melibatkan pengukuran dan interpretasi radiasi elektromagnetik yang diserap atau diemisikan ketika molekul, atau atom, atau ion, dari suatu sampel bergerak dari satu tingkat energi tertentu ke tingkat energi lainnya. Setiap atom mempunyai hubungan yang khas dengan radiasi elektromagnetik. Pembagian spektrum elektromagnetik sinar tampak terdapat pada daerah panjang gelombang 400 sampai 750 nm. Komponen warna yang terurai dari sinar putih dapat diserap dan sisanya diteruskan sebagai warna yang teramati secara kasat mata, sinar yang diserap dinamakan warna komplemen. Penggunaan spektroskopi sebagai sarana penentuan struktur senyawa memiliki sejarah yang panjang. Reaksi nyala yang populer berdasarkan prinsip yang sama dengan spektroskopi. Di pertengahan abad ke-19, kimiawan Jerman Robert Wilhelm Bunsen (1811-1899) dan fisikawan Jerman Gustav Robert Kirchhoff (1824-1887) bekerjasama mengembangkan spektrometer.

Dengan bantuan alat baru ini, mereka berhasil menemukan dua unsur baru, rubidium dan cesium. Kemudian alat ini digunakan banyak kimiawan untuk menemukan unsur baru semacam galium, indium dan unsur-unsur tanah jarang. Spektroskopi telah memainkan peran penting dalam penemuan gas-gas mulia. Metoda penyelidikan dengan bantuan spektrometer disebut spektrometri.

Spektrosfotokopi ultraviolet-visible (UV-Vis) adalah pengukuran jumlah radiasi UV-Vis yang diserap oleh senyawa sebagai fungsi dari panjang gelombang radiasi. Panjang gelombang serta intensitasnya ini tergantung dari jenis ikatan dan gugus karakteristik dari molekul (Christian 2004). Spektrum tampak (visibel) terentang dari sekitar 400 nm (ungu) sampai 750 nm (merah), sedangkan spektrum ultraviolet terentang dari 100 nm sampai dengan 400 nm (Fessenden and Fessenden 1986).

Serapan cahaya oleh molekul dalam daerah spektrum UV-Vis tergantung pada struktur elektronik dari molekul. Spektrum UV-Vis dari senyawa organik berkaitan erat dengan transisi-transisi elektron diantara tingkatan-tingkatan tenaga elektronik. Transisi-transisi tersebut biasanya antara orbital ikatan atau orbital pasangan bebas dan orbital non ikatan tak jenuh atau orbital anti ikatan. Tetapi dalam praktik, UV-Vis digunakan terbatas pada sistem-sistem terkonjugasi (Sastrohamidjojo 2001).

Spektrum UV-Vis adalah suatu gambar antara panjang gelombang atau frekuensi serapan lawan intensitas serapan (transmitasi atau absorbansi). Sering gambar ditunjukan sebagai gambar grafik atau tabel yang menyatakan panjang gelombang lawan serapan molar atau log dari serapan molar, E_max atau log E_max (Sastrohamidjojo 2001).

Beberapa istilah yang perlu diketahui dalam spektrosfotokopi ultraviolet-visibel adalah:

1.  Gugus kromofor, yaitu suatu gugus kovalen tidak jenuh yang dapat menyerap radiasi dalam daerah UV-Vis.

2. Gugus auksokrom, yaitu suatu gugus fungsional bersifat jenuh yang jika terikat pada suatu gugus kromofor maka akan menyebabkan timbulnya pergeseran puncak serapan gugus kromofor tersebut ke panjang gelombang yang lebih besar dan juga mempertinggi intensitasnya.

3.    Pergeseran batokromik adalah pergeseran puncak absorbsi ke arah panjang gelombang yang lebih besar (disebut juga red shift atau batocrhromic shift). Hal ini terjadi karena pengaruh pelarut atau efek substitusi.

4. Pergeseran hipsokromik (hipsocromic shift atau blue shift) adalah pergeseran ke arah panjang gelombang yang lebih kecil/pendek.

5.     Efek hiperkromik adalah efek yang disebabkan oleh gugus fungsi sehingga menyebabkan kenaikan nilai intensitas serapan maksimum.

6. Efek hipokromik adalah efek yang disebabkan suatu gugus sehingga menyebabkan penurunan nilai intensitas serapan maksimum.

7.     ε₁ ^1% cm adalah ekstingsi suatu lintasan sinar dengan panjang 1 cm dari larutan dengan konsentrasi 1%.

(Widodo dan Wijayanti 2002; Gandjar 1991)

Prinsip Dasar UV-Vis

Ketika cahaya mengenai larutan bening maka akan terjadi dua hal yaitu transmitansi dan absorbansi.

Absorbansi

Jika cahaya mengenai suatu bahan maka cahaya tersebut akan diserap jika energi cahaya tersebut sesuai dengan energi yang dibutuhkan untuk mengalami perubahan dalam molekul. Artinya cahaya tersebut akan mengeksitasi elektron dari tingkat energi terendah ke tingkat energi di atasnya. Pada molekul singel, tingkatan energinya disebut pita valensi yang berisi elektron dan pita konduksi yang tidak berisi elektron pada keadaan biasa. Untuk bahan organik, tingkatan energinya dikenal dengan istilah Highest Occupied Molecular Orbital (HOMO) dan Lowest Unoccupied Molecular Orbital (LUMO) seperti pada Gambar. Antara HOMO dan LUMO terdapat celah energi yang tidak ditempati oleh elektron. Elektron dapat berpindah dari HOMO ke LUMO  jika ada cahaya yang diserapnya minimal sama dengan besar energi celah (band-gap) (E_gap ≤ hu). Selain itu, elektron ini dapat dieksiasi ke tingkat energi yang lebih tinggi dengan menaikkan temperatur.

Laju dari berkas sinar yang masuk ke sistem penyerap akan berbanding lurus dengan intensitas sinar tersebut yang biasa disimbolkan dengan I_o, terjadinya penyerapan mengakibatkan penurunan intensitas sinar, yang akan keluar sebagai intensitas sinar yang telah melewati sampel dan disimbolkan dengan I. Dasar penentuan kuantitatif dari metode spektometri adalah Hukum Lambert-Beer. Hukum Lambert menyatakan bahwa penyerapan sinar tidak bergantung pada intensitas sumber cahaya. Hukum Beer menyatakan bahwa fraksi penyerapan sinar sebanding dengan banyaknya molekul yang menyerap. Sumber radiasi yang dipancarkan harus memiliki panjang gelombang yang sama untuk penyerapan agar memenuhi hukum Beer.

A adalah serapan cahaya sampel, I₀ adalah intensitas tanpa absorbsi, I merupakan intensitas cahaya yang keluar lewat larutan sampel,  l merupakan ketebalan lapisan larutan sampel (panjang jalur absorbsi), e adalah absorbsivitas  molar, yaitu besarnya serapan sinar dengan panjang 1 cm oleh zat yang konsentrasinya 1 molaritas, sedangkan C adalah konsentrasi analat (Indraswari 2008).

Syarat berlakunya Hukum Lambert-Beer :

·         Konsentrasi harus rendah

·         Zat yang diukur harus stabil

·         Cahaya yang dipakai harus monokromatis

·         Larutan yang diukur harus jernih

Nilai absorbansi larutan bertambah dengan pengurangan kekuatan sinar. Absorbansi berbanding lurus dengan ketebalan dan konsentrasi larutan serta berbanding terbalik dengan nilai transmitansi.

Transmitansi

Transmitansi larutan T merupakan bagian dari cahaya yang diteruskan melalui larutan dimana P_o adalah intensitas cahaya yang masuk dan P merupakan intensitas cahaya yang diteruskan oleh sampel.

Energi maksimum yang diserap oleh larutan ditunjukan pada panjang gelombang yang memiliki nilai absorbansi tertinggi dan % transmitan terendah. Energi maksimum dinyatakan dengan:

                                 

                                   E= h u atau E= h c/λ

dimana E = energi cahaya, h = konstanta Planck (6,67492 x10-34 Js), u = frekuensi, c = panjang gelombang cahaya (3 x 10⁸ ms^-1) dan λ = panjang gelombang.

Instrumen yang digunakan untuk mempelajari serapan atau emisi radiasi elektromagnetik sebagai fungsi dari panjang gelombang disebut “spektrometer atau spektrofotometer”. Komponen-komponen pokok dari spektrofotometer meliputi: (1) sumber tenaga radiasi yang stabil, (2) sistem yang terdiri atas lensa-lensa, cermin, celah-celah, dan lain-lain, (3) monokromator untuk merubah radiasi menjadi komponen-komponen panjang gelombang tunggal, (4) tempat cuplikan yang transparan, dan (5) detektor radiasi yang dihubungkan dengan sistem meter atau pencatat (Sastrohamidjojo 2001).

Sebuah spektrofotometer merupakan suatu instrumen untuk mengukur transmitans atau absorbans contoh sebagai fungsi dari panjang gelombang. Komponen dasar pada sebuah spektrofotometer baik spektrofotometer berkas tunggal atau ganda ialah sumber cahaya, monokromator, sel, detektor dan rekorder. Kelebihan spektrofotometer dibandingkan dengan fotometer yang lain ialah panjang dari sinar putih yang dapat lebih terseleksi dan ini diperoleh dengan alat seperti prisma, granting ataupun celah optis. Prinsip kerja dari spektrofotometer secara umum ialah suatu berkas radiasi dilewatkan melalui larutan dengan panjang gelombang tertentu, berkas radiasi akan diserap (diabsorbsi) secara selektif dan radiasi lainnya akan diteruskan (ditransmisikan) lalu ditangkap oleh detektor sebagai sinyal listrik yang bisa diukur.

Cara-cara analisis kualitatif dengan pengukuran absorbans menggunakan teknik spektrofotometri UV-Vis telah banyak dikembangkan seperti memakai kurva kalibrasi dari sederet larutan standar, adisi standar. Kurva kalibrasi dari sederet larutan standar sebaiknya mempunyai komposisi sama dengan komposisi contoh yang sebenarnya, dan konsentrasi contoh berada diantara kisaran konsentrasi standar. Metode adisi standar dilakukan dengan menambahkan larutan standar ke dalam larutan cuplikan maupun campuran cuplikan dan standar (Dini 2008).

Suatu molekul hanya menyerap radiasi elektromagnetik dengan panjang gelombang yang khusus (spesifik untuk molekul tersebut) absorbsi cahaya ultraviolet (radiasi berenergi tinggi) mengakibatkan pindahnya sebuah elektron ke orbital dengan energi yang lebih tinggi. Molekul-molekul yang memerlukan lebih banyak energi untuk promosi elektron, akan menyerap pada panjang gelombang yang lebih pendek. Molekul yang memerlukan energi yang lebih sedikit akan menyerap pada panjang gelombang yang lebih panjang. Senyawa yang menyerap cahaya dalam daerah visible (yakni senyawa berwarna) mempunyai elektron yang lebih mudah dipromosikan daripada senyawa yang menyerap pada panjang gelombang UV. Radiasi elektromagnetik dipancarkan dalam bentuk paket-paket energi yang menyerupai partikel yang disebut foton atau kuantum. Energi suatu foton berbanding terbalik dengan panjang gelombang. Radiasi dengan panjang gelombang lebih pendek mempunyai energi yang lebih tinggi, oleh karena itu sebuah foton cahaya UV berenergi lebih tinggi daripada foton gelombang radio) (Sjahid 2008).